生物化学第十三章重组DNA技术

一、重组DNA技术的概述
　　1.概念：
　　克隆：来自同一母本的所有副本或者拷贝的集合。
　　基因工程：获得大量DNA拷贝的过程。
　　具体就是说：基因工程在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。
　　它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。

　　基因重组包括：接合、转化、转导或转座。
　　基因转换：减数分裂过程中两条染色体非同源DNA片段的转移，不属于基因重组。

　　重组DNA的连接包括：
　　外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA 5 ’磷酸和相邻的3’羟基之间形成的新的共价键。
　　粘端连接
　　平端DNA连接
　　质粒载体中的快速克隆

　　限制性核酸内切酶：识别特异DNA序列，在识别位点及周围切割双链DNA的酶。
　　限制性内切酶可分为两大类,即I类酶和II酶。相当一部分酶（如EcoR I、BamH I、Hind等）的切口，作用点有180°旋转对称性,因而可形成粘性末端，但也有一些II类酶如 A1u I、BsuR I、Bal I、Hal III、HPa I、Sma I等切割DNA分子并不产生粘性末端，而只形成平整末端。

　　基因载体：噬菌体、病毒和质粒
　　质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸（DNA）分子。 已发现有质粒的细菌有几百种,已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子（简称cccDNA）。
　　理想质粒载体条件：
　　1.复制起始点。
　　2.有两种以上易被检测的选择性标记。
　　3.选择标记上具有多种限制酶的单一切点。
　　4.有尽可能小的相对分子质量。
　　5.属于松弛复制型。
　　6.为非传递性质粒。

　　相邻的5'磷酸和3'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。
　　实际上在有克隆用途中，T4噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。这是因为在下述反应条件下，它就能有效地将平端DNA片段连接起来。
　　pBR322质粒： DNA分子的长度为4363bp，此载体中有两个标记基因，一个是氨苄青霉素抗性基因（Apr），另一个是四环素抗性基因（Tetr）。现在已知pBR322DNA分子共有24种核酸内切限制酶的单一识别位点。其中7种限制酶（从12：00位置按顺时针方向）即EcoRV,NheI,BamHI,SphI,SalI，XmaIII和NruI的识别位点位于四环素抗性基因内部，另外有2 种限制酶即ClaI和HindIII的识别位点是存在于这个基因的启动区内，在这9个限制位点上插入外源DNA都会导致tetr的失活。
　　穿梭质粒：环形双链DNA，具有两个复制起始点，一个可在大肠杆菌中推动它的复制，另一个可在酵母细胞中推动复制
　　噬菌体：是寄生在细菌的病毒。M13是一类特异的大肠杆菌噬菌体，含单链环状的DNA。它感染细菌（宿主菌）呈溶原状态生长,在菌体内形成过渡阶段双链环状复制型DNA

　　聚合酶链式反应（PCR）：模板、酶、引物构成的体系，变性、退火、延伸可以得到大量的DNA拷贝的过程。
　　PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
　　PCR变性温度一般为：95℃，加热3-5分钟
　　PCR引物退火温度一般为：40℃～60℃
　　引物延伸温度一般为：72℃
　　Klenow DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段，它可用于填补DNA单链末端成为双链。
　　Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌
　　（Thermusaquaticus）yT1株分离提取的。
　　2.基因工程基本原理
　　分、切、接、转、筛，即：
　　（1）目的基因的获取
　　（2）克隆基因载体的选择与改造
　　（3）目的基因与载体的连接
　　（4）重组DNA分子导入受体细胞
　　（5）筛选出感兴趣基因
　　Western印迹杂交，是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。
　　Northern印迹用于检测RNA.
　　Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法
　　二、基因工程与医学
　　1.疾病相关基因的发现
　　2.生物制药
　　3.基因诊断
　　4.基因治疗（导入具有相应功能的外源基因）
　　5.遗传病的防治
　　本章重点
　　重组DNA技术的一些重点概念